许多化合物可诱导机体产生基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目异常等不同形式的DNA损伤，从而造成机体潜在的遗传危害。致癌实验可检出机体DNA损伤及其损伤的形式并甄别这些化合物的致癌性，在实验中呈阳性的化合物为潜在人类致癌剂和(或)致突变剂。致癌实验可分为活体内致癌实验(整体动物实验)与试管内致癌实验。比较于活体内致癌实验．试管内致癌实验具有简单易行、快速灵敏的优点。试管内致癌实验是采用组织细胞培养法来观察致癌剂的致癌作用。实验中真核细胞更能直接地检出致癌剂对人类或其他高等生物的遗传危害；根据致癌剂类别选择合适的细胞，观察细胞DNA损伤的形式及程度来判定致癌剂的致癌特性。

一、原理

    DNA分子量很高且具有严密的超螺旋结构。因此，在理想条件下，正常细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。而DNA受损后，DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来；由于这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链，所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动，形成慧星状图像，故称彗星试验。DNA受损伤愈严重，产生的断链和变性片断就愈多，断链也愈小；在相同电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度，确定致癌剂与DNA损伤效应之间的关系。

二、材料与方法

(一)实验材料

1．待检人抗凝外周血。

2．磷酸盐缓冲液PBS。

3．0．4mmol／LTris—HCl(pH7．5)。

4．0．5％正常熔点琼脂糖(NMA)。

5．0．5％低熔点琼脂糖(LMA)。

6．细胞裂解液 含2．5mol／L NaCl、100mmol／L Na2 EDTA、10mmol／L Tris—Hcl(pHl0)、1％肌氨酸钠，用前加lO％二甲基亚砜。

7．电泳缓冲液1 mmol／L Na2EDTA、300mmol／L NaOH。

8．30 μg／ml溴化乙啶(EB)。

9．淋巴细胞分离液比重I．077~1．080g／ml。

(二)实验方法

1．人外周血淋巴细胞分离从健康人静脉采抗凝血0．5~lml，沿离心管管壁滴加在等体积淋巴细胞分离液液面上，3500 r／min离心2min，吸取中间层淋巴细胞于10ml离心管中，加磷酸盐缓冲液(PBS)至5ml，1500r／min离心8min，如此重复洗涤细胞两次，再将细胞悬于PBS，置4℃待用。

2．紫外线照射或化学处理取新鲜分离的淋巴细胞或其他细胞悬液，用PBS调整细胞浓度为1×105个细胞／ml，用待测化学物37℃处理2～4h或于冰水浴中经紫外线照射，随后将细胞保存在4℃或冰水浴中。

3．三层凝胶法制板将i00pI NMA 40℃预热后滴在载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，4℃凝固。将10p1含有1000个受检人血淋巴细胞的PBS和75μl LMA 37℃预热并混合，滴到*层琼脂糖上，4℃凝固。滴加75μl 37℃预热的LMA于第二层琼脂糖上，盖上盖玻片4℃凝固。

4．细胞裂解将凝胶水平浸入新配制的预冷的4℃细胞裂解液，破坏细胞膜、核膜和其他生物膜。

5．DNA碱解旋将凝胶取出，用吸水纸吸干裂解液，并置于水平电泳槽的阳，电泳槽中盛有新配制的碱性电泳缓冲液，放置40min，使DNA在碱性条件下解螺旋。

6．单细胞电泳在电压25V、电流300mA下，电泳40min。

7．中和与染色 电泳后将载玻片凝胶平放在小瓷盘内，缓缓沿壁加入Tris—HCl(DH7．5)缓冲液，将凝胶淹没15 min，再将Tris—HCl缓冲液吸去，用滤纸将盘内液体吸干，再缓缓加入无水乙醇将凝胶浸埋lh。之后，吸去乙醇，晾干或室温下过夜。每块凝胶加50μl EB水溶液，再盖上盖玻片染色20min。

三、结果观察

    染色后的样本应尽快在荧光显微镜下观察电泳图像，每个样本随机选择25个细胞，尽快用目镜测微尺测定核DNA直径和DNA迁移的长度。有条件者可借助图像分析仪进行分析。