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胸腺素a1抗体的制备及其效价测定

时间:2012-04-26      阅读:1120

胸腺素a1抗体的制备及其效价测定

【摘要】  目的 制备用于检测胸腺素α1基因工程表达产物的特异性抗体。方法 以提纯的胸腺素α1与牛血清白蛋白偶联后作为抗原,皮下多点注射免疫大鼠。经过3个月的免疫,获得抗胸腺素α1的多克隆抗体。结果 用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,测定抗体效价超过5,000,显示该抗体能与胸腺素α1抗原特异性地产生明显免疫反应。结论 采用本法制备的抗体具有很好的灵敏性和特异性。为胸腺素α1的分离纯化及大规模,从而为进一步满足临床需要奠定了基础。 

【关键词】  胸腺素α1抗体 酶联免疫吸附反应

  胸腺素(Thymosin α1Tα1)作为一种生物反应调节剂(BRM)14,在临床中具有良好疗效,主要治疗乙型肝炎〔56〕、丙型肝炎〔7〕及多种恶性肿瘤〔89〕,也用于艾滋病等免疫缺陷性疾病的治疗。制备Tα1特异性的抗体对于Tα1基因的表达产物的鉴定至关重要。本文用大鼠作为免疫动物,采用皮下多点免疫注射的方法,获得了满意的抗Tα1抗体。

    材料与方法

  1 材料与试剂                         

  Tα1购自市售成都地奥九泓制药厂,规格16 mg/;牛血清白蛋白、*福氏佐剂及不*福氏佐剂、辣根酶标记山羊抗大鼠Ig G(H+L)均购自北京鼎国生物公司;大鼠,雌性,68周龄,225234 g,由吉林大学基础实验动物室提供。

  1  方法

  12 制备偶联复合体                         

  用pH 7401 mol/L PBS 缓冲液溶解Tα1BSA,缓慢加入60%05 mol/L NaCl,使Tα1的终浓度为01 mg/ml,置于振荡器中轻微振荡3 h

  

  12  制备抗体血清

  122 卡介苗致敏                         

  在动物饲养室内饲养大鼠6,观察2 w,其健康状态良好后,每只大鼠后足掌皮下注射005 ml卡介苗。

  1222   第1次免疫注射                         

  卡介苗致敏2 w,BSATα1偶联产物做抗原,与等体积*福氏佐剂充分乳化后,免疫注射。位点在大腿肌肉腹股沟处,每点皮下注射02 ml,阴性对照注射等量生理盐水。

  122 第2次免疫注射                         

  *次免疫注射2 w,选择脊椎两旁各4个位点,腹股沟各1,每点02 ml进行皮下免疫注射。

  122 第3次免疫注射                        

   2 w,免疫注射位点在背部脊柱旁各3,腹股沟及腋下各1,每点02 ml

  122 加强免疫                         

  第3次免疫注射后,每隔2025 d,以不*福氏佐剂与Tα1BSA偶联复合物经充分乳化后进行背部多点免疫;zui后1次免疫后的第7天采血,4℃冰箱过夜,离心分离血清。用ELISA法测定其效价,达到要求后,眼球取血,获得血清,分装保存在-20℃冰箱备用。

  123 抗血清的纯化                         

  用硫酸铵盐沉淀提纯抗体〔1012〕。

  1231 盐析                        

   取分离后获得的血清与等量生理盐水混合稀释,于搅拌下逐滴加入等量的饱和硫酸铵,使其终浓度为50%,4℃冰箱过夜,使其充分沉淀。经离心后弃去上清,以生理盐水溶解沉淀。再逐滴加入饱和硫酸铵,使其终浓度为33%4℃冰箱过夜。重复用50%33%的饱和硫酸铵依次提取。将末次离心后所得沉淀物以002 mol/L PBS溶解后装入透析袋。

  123 除盐                        

   将盛装盐析物溶液的透析袋置于大烧杯中,在电磁搅拌下,以蒸馏水和生理盐水交替透析48 h,此过程每隔34 h换液。

  12 ELISA法测定抗体效价

  124  包被                         

  用pH 96碳酸盐缓冲液稀释Tα1至终浓度μg/ml,包被酶标板,将酶标板放入湿盒中,置4℃冰箱过夜。

  1242   封闭                         

  封闭液用pH 74 PBSTween 20,加5%脱脂奶粉。

  1243   加一抗                         

  以pH 74 PBSTween 20奶粉为稀释液,将免疫后的大鼠阳性血清作不同梯度稀释;阴性对照用未免疫的大鼠阴性血清。

  1244   加酶标二抗                         

  用pH 74 PBSTween 20脱脂奶粉按11 000稀释酶标二抗山羊抗大鼠HRP

  124 加底物                         

  加入TMB显色液,37℃避光显色1520 min,加入2 mol/L H2SO4 终止反应。

  124 读数                         

  用酶标仪在490 nm波长下读取吸光值。每次操作间采用浸泡式洗涤方法充分洗涤3次,以除去多余的游离反应物。

  1 统计学处理                       

  采用SPSS115软件包处理数据。

胸腺素a1抗体的制备及其效价测定

  2 结果

  21 抗体的制备                         

  本次实验所用大鼠在三个月的免疫过程中状态良好,无一例死亡,其免疫前后体重变化无明显差异(P005)见表1。免疫结束,每只大鼠眼球取血获得56 ml的免疫血清。表免疫前后大鼠体重变化(略)

  2 抗体的ELISA检测                         

  以未免疫的大鼠血清作为对照,用制备的抗体作为一抗进行ELISA检测,均有阳性反应,均为P/N21(P:阳性血清OD490N:阴性血清OD490),测得OD值,见表2。表2  ELISA检测抗体效价(略)

                             

  2胜*提纯抗体与未提纯抗体的比较                          

  经采用相同针剂、相同条件以提纯和未提纯的抗体作ELISA检测,发现提纯的抗体其阳性反应明显比未提纯的抗体强。110时,提纯抗体与未提纯抗体两组比较P001110011 00013 00015 000时,两组比较P005。证明提纯抗体特异性,灵敏度均比未提纯的效果好,检测结果见表3。表3  提纯抗体与未提纯抗体的比较(略)

                  

  Tα1为免疫原性差的小分子量肽,而能分别将药物与载体蛋白的伯氨基以五肽链的桥连接起来〔11〕,Tα1与载体蛋白偶联后免疫动物,能提高其免疫原性。选择大鼠做免疫动物的优点是,大鼠活力强,饲养条件要求较低,免疫中途死亡率低,本次实验所用大鼠在三个月的免疫过程中状态良好,均未死亡;此外,大鼠个体适中,所需抗原用量不大,而且其体积比小鼠大,收获血量相对多,制备的血清量大。本实验采用上述方法,从一只大鼠中可以获得56 ml的免疫血清。此外,制定合理的免疫程序也是获得理想抗体的关键,抗原免疫前使用卡介苗致敏,能够明显调动大鼠免疫系统,产生较强的免疫反应,并对产生高滴度的抗Tα1抗体有促进作用。ELISA是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的催化作用相结合的实验技术,具有特异性强,灵敏度高的优点,在适宜条件下,能准确测定血清抗体效价。由于所制备的抗体与BSA偶联,因此,在包被液和一、二抗抗体稀释液中不应包含BSA,本试验用浓度为5%的脱脂奶粉作封闭,达到较好的效果。本实验为检测Tα1表达产物提供了灵敏度高,特异性强的抗体,Tα1的分离纯化及大规模,从而为进一步满足临床需要奠定了基础。

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