荧光定量PCR常见问题及解答

一、无 Ct 值（信号）出现：

    1.反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；

    2.检测荧光信号的步骤有误：一般采用 72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；

    3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

    4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；

    5.模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的zui高浓度做起；

    6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。

二、如何确认模板中是否含有 PCR 反应阻害物质：

    有时RNA或cDNA模板中存在对反转录和荧光PCR 反应的阻害物质。为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按 3－4 个梯度稀释，并使用其进行荧光定量 PCR 反应。如果无阻害物质存在，得到的 Ct 值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。

三、Ct值出现过晚：

    1.反应条件不佳：未*反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；

    2.PCR各种反应成分的降解或加样量不够；

    3.扩增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。

四、标准曲线的线性关系不佳：

    1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；

    2.标准品降解：标准品尽量避免反复冻融；

    3.引物或探针不佳：重新设计；

    4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

五、阴性对照液出现明显的扩增：

    1.荧光 PCR mix 或水被污染；

    2.引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；

    3.反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。

六、溶解曲线不止一个主峰：

    1.引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；

    2.引物浓度不佳：适当调整引物浓度；

    3.退火温度低：提高退火温度；

    4.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；

    5.模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。

七、如何避免荧光定量PCR中基因组DNA扩增：

    1.引物设计时避免基因组DNA扩增；

    2.在RNA提取过程中使用DNaseⅠ处理去除RNA中混有的基因组DNA。

荧光定量PCR常见问题及解答

八、扩增效率低：

    1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；

    2.反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法；

    3.反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。

九、重复性不好：

    1.加样不准确；

    2.仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；

    3.模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。

十、扩增曲线不正常，刚进入指数期就很快进入平台期并向右下弯曲：

    1.基线等设置不当：按仪器说明书重新操作；

    2.模板量过多：当扩增曲线在10个循环内起峰时，应将模板稀释100－1000倍后使用。

十一、各孔间的荧光信号如何进行校正：

    由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因素对定量结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实现，一般采用红色ROX荧光，称为阳性参比信号。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。ROX校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异。

十二、荧光定量PCRCT值一般在多少后认为模板没扩增：

    当进入对数期的循环数大于35时，Real Time RT-PCR检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在 32-35 个循环时，需要有至少 3 个重复才能判断是否能检测到基因的表达。