研生试剂-细胞受体结合免疫测定CIC法
时间：2014-05-28 阅读：577
细胞受体结合免疫测定法是根据CIC可与某些细胞表面的Fc受体或补体受体结合而建立的细胞技术，这类方法有灵敏度较高，特异性较强等优点，但需进行活细胞培养或细胞分离，影响因素多，重复性较差，目前仅适用于实验研究。此类技术有多种方法。
Raji细胞是从Burkitt淋巴瘤患者分离建株的B淋巴细胞系。可在体外连续传代培养，细胞表面没有膜免疫球蛋白，Pc受体的亲和力很低，但有C3、C3b和C3d受体及Clq受体，而且不易脱落。因此能使结合补体的IC吸附在细胞上，然后再于反应系统中加入荧光素或i125标记的抗人IgG抗体，使其与结合在Raji细胞上的IC中的IRC反应，计算Rail细胞上结合的IC中渗入的核素量，即可判定IC的存在与含量。
(一)试剂
1．Raji细胞悬液 将Raji细胞培养在含20％小牛血清的RPMI-1640培养液中2—3d后即可收集应用，该细胞培养时不贴壁、不结团，生长容易(一般3d即可传一代)，培养条件不苛求。但pH值应在6．5左右，超过pH7．0则生长不良。收集细胞时要计数和检查活细胞，台盼蓝排除试验要求活细胞在95％以上。
2．核素标记抗IgC抗体 将兔抗人IgC血清经DE52分离兔IsC，用PBS稀释成蛋白质1mg／mL，按每ug蛋白质结合0．3uCi125I标记抗人IgC抗体。
(二)操作步骤
1．取培养72h的Raji细胞1 800r／rain离心10rain，弃去上清液，细胞沉淀中加入不含小牛血清的1640培养液，洗2次。
2．计数Raji细胞数，用*1640培养液配成107／mL细胞悬液。
3．取1滴细胞悬液加等量0．1％台盼蓝，放37℃10rain，镜检着色细胞不应超过5％。
4．在试管中加入细胞悬液501~L，再加入1：4稀释的受检血清25uL。
5．摇匀后放37~(2 45rain，每5-10rain轻摇一次，使其充分作用。
6．用1640培养液将细胞洗涤3次，1 000r／min离心5min，弃去上清液。
7．在细胞沉淀物中加125I标记的抗人TgG抗体，用含1％人血清白蛋白(HSA)的1640培养液将标记物稀释成7-10ug／mL。加入标记物后置4℃30min，每间隔5—10min轻摇1次。
8．用含1％人血清白蛋白(HSA)的1640培养液洗涤3次，每次1 800r／rain离心10min。
9．取细胞沉积物用Y计数器测cpm值。
10．用热变性IgG40ug溶于50uL新鲜混合人血清中，然后倍比稀释成10个稀释度，按上述方法操作测定cpm。
(三)结果判断
以热聚合IgC的含量为横坐标，cpm为纵坐标绘制标准参考曲线。自参考曲线查出IC中IgC的ug数，按ug/mL报告。
(四)注意事项
1．Raji细胞有时也带有Pc受体和表面膜免疫球蛋白，为使实验结果反映真实情况，应预试条件，同时在实验中加阴性对照。
2．用热变性IsC作对照和参考时，一定要用新鲜血清作稀释剂，以补充补体。
除此以外，细胞受体结合免疫测定方法中的血小板凝集试验亦用于实验研究。其原理是免疫复合物与血小板相互作用后引起血小板表面发生改变，导致血小板凝集(有人认为血小板凝集与其表面Fc受体活化有关)。试验中必须采用新鲜分离的有活力的血小板，因为在IC存在时，血小板表面的改变有赖于其代谢状态。除IC外，高浓度的游离免疫球蛋白与血小板表面抗原反应的抗体和其他物质，如荷电分子、蛋白水解酶和某些粘病毒也可使血小板聚集；Clq、IgM、RF能抑制IC引起的血小板聚集；待检血清于试验前加热灭活，会使其血小板凝集滴度升高或降低。